mRNA技术的应用领域非常广泛，目前主要用于传染性疾病疫苗、肿瘤免疫治疗、蛋白替代疗法和基因编辑等方面，尤其在肿瘤免疫治疗和传染性疾病疫苗的应用上较为突出。公开数据显示，全球有超过150个mRNA疫苗药物项目正在推进，明确获批及进入临床阶段的也有近百个，其中大约70%为感染性疫苗项目，约30%为肿瘤治疗性疫苗项目。

今年的诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家卡塔林·卡里科和德鲁·魏斯曼，以表彰他们“他们发现了核苷碱基修饰，从而开发出有效的新冠肺炎mRNA疫苗”。本文总结了mRNA的其他更多重要修饰。

图1 mRNA疫苗的作用机制（Wadhwa A et al. 2020）

体外合成mRNA的修饰

1. 5′端加帽

RNA聚合酶催化RNA的转录合成，这一过程中以DNA为模板；RNA聚合酶作用于DNA模板链的3’端，RNA链从5’端向3’端延伸。转录的同时，mRNA的5’端进行加帽反应，7-甲基鸟嘌呤通过5’-5’三磷酸键与mRNA的5’端连接。根据甲基化修饰的程度不同分为3种帽结构：Cap0、Cap1和Cap2（图3）。

体外合成的RNA需要通过一定的合成过程完成5’端帽结构的添加，从而形成完整的mRNA结构。mRNA的完整性确保了蛋白质的准确翻译，5’-Cap帽结构修饰可以保护mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促进翻译的起始、降低免疫原性。常用的加帽工艺有两类，一类是在IVT结束后，通过牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶的共同作用，完成Cap1的修饰；一类是在IVT过程中，通过在体系内引入帽类似物，完成帽结构的修饰。两种方式在工艺、结果以及知识产权壁垒等方面各不相同。

图3 酶法加帽和共转录加帽的比较，图片引用于 Novoprotein Scientific Inc.

酶法加帽过程：在RNA三磷酸酶作用下，mRNA 5’端γ-磷酸基团被去除，生成5’-二磷酸RNA；在鸟苷酸转移酶（guanylyl-transferase）作用下，GTP中的GMP基团与5’-二磷酸 RNA连接；在鸟嘌呤N-7甲基转移酶（guanine-N(7)-methyltransferase）作用下，鸟嘌呤的N7位发生甲基化（甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸[SAM]），形成帽结构Cap0（m7GpppNpNp）。而后在2’-O核糖甲基转移酶（2’-O Ribose methyltransferase）作用下，mRNA第一个核苷酸的2’-O位发生甲基化，形成帽结构Cap1（m7Gpppm2’NpNp）；mRNA第一个和第二个核苷酸的2’-O位均发生甲基化，形成帽结构Cap2（m7Gpppm2’Npm2’Np）（图5）。

图4 真核生物mRNA中酶促5 '端帽形成的示意图（Muttach F et al. 2017 ）

近岸蛋白提供mRNA加帽过程中所需的2种加帽酶:牛痘病毒加帽酶（目录号：GMP-M062、M062）和mRNA Cap2’-O-甲基转移酶（目录号：GMP-M072、M072）及完整试剂盒（目录号：M082）。

2. 3′-端加尾

体外合成mRNA的加尾方式主要有两种：(A)通过Poly(A) Polymerase酶促方式加尾；(B)在模板上引入编码PolyA的序列（图6）。PolyA尾与通过核膜有关，还可防止核酸外切酶降解。这种多聚腺苷酸尾巴很重要，它的长度确定了mRNA在细胞中的存在时间，以及细胞利用mRNA表达蛋白的频率。这种多聚腺苷酸尾巴也是mRNA从细胞核中迁移出去所必需的。早期基于实验证据的假说认为，Poly(A)尾与胞浆中的多聚腺苷结合蛋白（PABPC）促进翻译并阻止mRNA降解（decay），但具体机制并不清楚。最近对Poly(A)尾的作用认识更加丰富：Poly(A)结合蛋白可以促进Poly(A)的去除（即发生脱腺苷化，deadenylation），而当mRNA稳定且高频翻译时，Poly(A)在稳态下的长度远低于预期。此外，翻译延伸的速率会影响脱腺苷化。因此，Poly(A)尾、PABPC、翻译过程和mRNA降解间的相互作用在基因调控中起重要作用。

图5 2种加尾方法：(A)转录后酶促加尾；(B)用 Bsal 将模板线性化后进行转录

近岸蛋白提供mRNA加尾过程种所需的加尾酶 E. coli Poly(A) Polymerase （目录号：GMP-M012、M012）。

3. 化学修饰

mRNA中还存在很多化学修饰，有碱基的修饰，也有核糖的修饰。这些修饰可以参与mRNA的剪接、核输出、转录本稳定性和翻译起始等事件，进而调控多种生理及病理过程。迄今为止共鉴定出超过170种RNA化学修饰，mRNA中常见的修饰包括N⁶-甲基腺苷（N⁶-Methyl-Adenosine，m⁶A），5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m⁵C），N¹-甲基腺苷（N¹-methyladenosine ，m¹A)，N⁷-甲基鸟苷（N⁷-methylguanosine ，m⁷G)，N⁴-乙酰胞嘧啶（N⁴-acetylcytosine，ac⁴C)，假尿苷（Ψ），肌苷（I）和核糖甲基化（2'-O-Me），5-甲氧基-尿苷（5-Methoxy-Uridine，5moU）等。其中m⁶A最为普遍，研究也较多（图7）。

图6 真核生物mRNA的化学修饰成分（Cui L et al. 2022）

近岸蛋白提供mRNA体外合成所需的NTPs (ATP/GTP/CTP/UTP目录号：GMP-S023/S024/S025/S026)和修饰核苷酸pUTP/N1-Me-pUTP（目录号：GMP-S048/GMP-S042）。

所有RNA修饰都可以通过它们的“writers”添加到mRNA上，m⁶A和m¹A修饰可以通过指定的“erasers”去除，因此使这些RNA修饰动态可逆。一些RNA修饰可以被它们各自的解读蛋白识别，从而通过改变靶RNA的产生、运输、功能和代谢改变靶RNA的命运。如下图所示，mRNA不同的位置有着对应的不同化学修饰（图8）。

图7 化学修饰在mRNA中的位置（Cui L et al. 2022）

采用修饰核苷酸合成的mRNA可以通过体外转录技术经济高效地大规模生产，并且可以在细胞质中快速瞬时表达，而不会有整合到基因组中的风险。然而，未修饰的合成mRNA不稳定并刺激细胞先天免疫的激活。由于环境RNA酶的高活性，未修饰的合成mRNA在很大程度上存在降解问题。进入细胞后，未修饰的RNA分子会被多种信号受体识别，例如内体Toll样受体、细胞质蛋白激酶R、2′-5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）或黑色素瘤分化相关基因5（MDA5），并诱导I型干扰素、白细胞介素-6和其他促炎细胞因子的产生，从而刺激细胞先天免疫的激活。

修饰核苷酸主要是通过阻碍信号受体识别mRNA，避免下游信号通路的激活从而逃避先天免疫反应。Ψ通过阻碍TLR7/8、PKR、OAS和RIG-I介导的信号通路的刺激来降低细胞内先天免疫原性。值得强调的是，这些细胞受体不仅能感知某些修饰的存在与否，还能感知RNA链特征（单链或双链RNA）以及碱基修饰的位置和组合。m⁵C通过阻止TLR7/8，PKR和RIG-1介导的信号通路的的刺激来降低细胞内先天免疫原性，并稳定mRNA，从而延长半衰期。m⁶A修饰可降低TLR3/7/8、PKR、MDA5、OAS和RIG-I与mRNA的结合，从而逃避先天免疫。

近岸蛋白mRNA技术-原料/服务一站式解决方案提供包括T7 High Yield RNA Transcription kit (E131) 在内的RNA体外转录所需的多种原料酶和相关辅助试剂，可以满足广大研究者多方面的生产和实验需求。

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Cat. No.	Product Name
E131	T7 High Yield RNA Transcription kit
E137	T7 High Yield RNA Transcription Kit (N1-Me-Pseudo UTP）
E139	T7 High Yield RNA Transcription Kit with CAP1 GAG （3´OMe）
E141	T7 High Yield RNA Transcription Kit with CAP1 GAG
M062	Vaccinia Capping Enzyme
M072	mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase
M082	Cap 1 Capping System
M012	E. coli Poly(A) Polymerase
E127	DNase I
GMP-S023A	ATP, GMP Grade
GMP-S026A	UTP, GMP Grade
GMP-S025A	CTP, GMP Grade
GMP-S024A	GTP, GMP Grade
GMP-S042	N1-Me-Pseudo UTP, GMP Grade
GMP-S048	Pseudo UTP, GMP Grade
MR008	eGFP mRNA
MR010	eGFP mRNA（N1-Me-Pseudo UTP）
MR009	Luciferase mRNA
MR011	Firefly Luciferase mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)
MR016	hEPO mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)
MR015	OVA mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)
MR105	mCherry mRNA（N1-Me-Pseudo UTP）
MR201	eGFP circRNA
MR202	Luciferase circRNA
MR019	Cas9 mRNA (N1-Me-Pseudo UTP)
MR107	Cas9 mRNA

  

参考文献：

1 Wadhwa A, Aljabbari A, Lokras A, Foged C, Thakur A. (2020) Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-based Vaccines. Pharmaceutics. Jan 28;12(2):102.2 Chen Y, Guo D. (2016) Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virol Sin. Feb;31(1):3-11.3 Muttach F, Muthmann N, Rentmeister A. (2017) Synthetic mRNA capping. Beilstein J Org Chem. Dec 20;13:2819-2832.4 Cui L, Ma R, Cai J, Guo C, Chen Z, Yao L, Wang Y, Fan R, Wang X, Shi Y. (2022) RNA modifications: importance in immune cell biology and related diseases. Signal Transduct Target Ther. Sep 22;7(1):334.