肝脏是人体中最大的器官之一，是调节营养吸收和代谢的主要器官，能够中和摄入的有毒化合物，并产生体内近50%的循环蛋白质。肝脏由多种细胞类型组成，其中占比最高的是功能多样的肝细胞。

 

肝脏作为重要的“解毒”器官，在执行日常功能时会受到各种代谢、病毒的侵害，可能会导致不同程度的肝损伤。长期损伤形成的纤维化疤痕破坏了肝脏的完整性，并且还会诱导门静脉高血压等其它疾病。在大多数肝脏疾病和药物诱导的肝损伤(DILI)中，损伤始于肝细胞，同时也会激活其它类型细胞（如：KC和HSC）。因此，为了充分理解每种肝病的表型和损伤器官的机制，我们需要建立复杂的体外肝模型，以便于更好地进行肝脏相关的疾病和毒性研究。

 

本篇文章基于Nature protocols^【1】和Journal of hepatology^【2】发表的两篇文章，整理了人类诱导多能干细胞（human iPSCs）来源的肝脏类器官培养方案。
 

 

图1. 人iPSCs来源的肝类器官培养方案^【2】

 

细胞来源

Human iPSCs

 

培养基配方

 

iPSCs培养和传代

 

1.将100mm培养皿包被5ml 0.1%（w/v）的明胶，室温静置15min至明胶凝固。

2.在明胶上接种丝裂霉素处理过的MEFs细胞悬浮液，细胞数约为1.8×10⁶个。放置在37℃，5%CO₂的培养箱中培养至细胞汇合度70-80%时进行传代。

3.吸去MEFs培养基，将iPSCs接种于明胶上，添加10ml iPSCs（I）培养基，放置在37℃，5%CO₂的培养箱中培养3-5天。
 

定向内胚层分化

 

4. 在60mm培养皿中加入2ml Matrigel，室温静置2h并添加DMEM-F12培养基至完全没过Matrigel。

5. 用不含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS冲洗iPSCs后，加入300μl Accutase，37℃孵育3-4min。

6. 将消化下来的细胞悬液收集并90g离心5min，收集细胞沉淀并加入iPSCs（II）培养基，同时进行细胞计数。

7. 将iPSCs接种在Matrigel平板上，接种密度为1.5×10⁶个/60mm平皿，接种后添加4ml iPSCs（II）培养基，放置在37℃，5%CO₂的培养箱中过夜培养。

8. 接种后第二天，用DEs培养基进行换液，放置在37℃，5%CO₂的培养箱中培养6天，每2天换液一次。
 

肝内胚层分化

 

9. 用HEs培养基进行换液，放置在37℃，5%低氧的培养箱中培养3天。

10. 用HEs（II）培养基进行换液，放置在37℃，5%低氧的培养箱中培养4天，之后转移至常氧条件下培养8天，达到肝成熟。
 

类器官培养

 

11. 肝成熟后的9-12天，在单层肝细胞上会出现三维结构，此时将漂浮的囊泡状细胞收集起来，加入Matrigel并放置在37℃条件下10min使Matrigel凝固。

12. 添加HM培养基并完全没过Matrigel顶部，每3天更换培养基，每7天机械传代一次类器官。

类器官扩增和分化

 

13. 将HM培养基吸出，用PBS清洗后，加入EM培养基，放置在37℃，5%低氧的培养箱中培养4天进行类器官扩增。

14. 随后用DM培养基进行换液，放置在37℃，5%CO₂的培养箱中培养6天，完成进一步分化。
 

图2. 扩增培养基（EM）和分化培养基（DM）孵育后的肝类器官免疫荧光图^【2】

 

肝类器官应用前景
 

类器官是一种能够进行体外更新和自组装的模型，相比于传统的二维(2D)细胞培养，类器官的生长环境更贴合生理条件。3D培养的肝类器官可以用于疾病建模，以便确定疾病的机制以及治疗方法。研究表明，3D培养的iPSC来源的肝类器官比2D干细胞更易感染乙型肝炎病毒^【3】。2019年Ouchi, R.et al.^【4】利用iPSCs来源的肝类器官，在体外模拟了炎症和纤维化，为进一步了解Wolman疾病打下了基础。

 

在药物毒性验证方面，肝类器官同样发挥着重要的作用。对乙酰氨基酚是药物引起肝衰竭的最常见来源，利用肝脏类器官可以实现药物的肝毒性验证，更适用于未来的药物筛选和开发^【5】。

 

类器官作为一种研究模型，在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面潜力巨大。但是，类器官培养技术建立过程中会面临多种挑战。为了更轻松更高效的建立类器官培养技术，欢迎各位扫码加入类器官培养交流群，在这里会有专业的技术支持人员帮您解惑答疑，也将定期分享类器官前沿进展，让类器官培养更简单！

 

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参考文献

【1】TAKEBE, Takanori, et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature protocols, 2014, 9.2: 396-409.

 

【2】MUN, Seon Ju, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of hepatology, 2019, 71.5: 970-985.

 

【3】Nie, Y. Z. et al.(2018). Recapitulation of hepatitis B virus–host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine, 35, 114-123.

 

【4】Ouchi, R. et al. (2019). Modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. Cell metabolism, 30(2), 374-384.

 

【5】Sgodda, M. et al. (2017). A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features. Stem cells and development, 26(20), 1490-1504.