mRNA作为疫苗及药物，最终应用于人体，其质量控制需要与其他药品一样，安全可控是最基本的要求。根据中国《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》，要求对RNA类基因修饰系统工艺参数进行过程控制检测，如加帽率、加Poly(A)尾长度及分布、mRNA序列完整性、序列准确性等。同时，USP的两版《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》也都涵盖了关于mRNA加帽率等质量属性的检测要求及检测方法建议。

 

 

mRNA的完整性确保了蛋白质的准确翻译，5’-Cap帽结构修饰^[1]可以保护mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促进翻译的起始、降低免疫原性。按照GMP标准条件，每生产一批mRNA都需要对mRNA的加帽率等进行严格测定，mRNA加帽率检测是mRNA质量控制的重要指标。

 

加帽率检测过程

 

1. 检测原理

利用一种特殊裂解探针法进行mRNA加帽率分析。通过设计mRNA 5’端互补探针，退火形成RNA/DNA杂合链，利用RNase H在特定位置从mRNA的5'末端切割短序列，并用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）分析获得加帽率。

 

2. 探针设计

根据目标样品5’端序列，进行酶切探针设计。为了方便加帽率检测探针设计，降低序列转换错误率，减少酶切产物等分子量计算工作量，近岸蛋白特别推出“mRNA加帽率检测工具箱”，包括探针设计、反应体系计算、酶切产物分子量计算等模块，网址https://www.novoprotein.com.cn/tool-class。注册近岸蛋白官网，拥有一个自己的专属账号，就可以轻松完成加帽率检测准备工作。

 

 

在探针设计方面，近岸蛋白依靠丰富的加帽率检测经验，优化探针设计原则，区别于传统设计方案中RNA+DNA探针序列，将探针中DNA碱基设计在2'-O-甲基修饰的RNA碱基序列中间，形成RNA+DNA+RNA序列，既保证了探针结合，又减少了非特异性酶切的发生。

 

传统探针设计方案酶切后结果：次裂解产物较多，非特异性酶切情况复杂，影响LC-MS结果分析。

 

近岸蛋白探针设计方案酶切后结果：既保证了探针结合，又减少了非特异性酶切的发生，次裂解产物少，方便LC-MS结果分析。

 

3. 样品前处理 

 

此处理将探针与目标mRNA退火形成DNA/RNA杂交双链后，引导RNase H在特定位置切割mRNA。再用链霉亲和素磁珠捕获与切割的片段配对的生物素标记的切割探针，将切割片段分离。最后更换溶剂条件，从探针中释放结合的mRNA，含有裂解产物与探针的上清液用于LC-MS分析。

 

针对很多客户面临的实验效率低，重复性不佳的问题，近岸蛋白重磅推出磁珠法样品处理完整试剂盒（目录号：CD001），涵盖所有加帽率样品处理所需试剂，用户只需要准备mRNA样品即可。

 

产品特点：

1）一步完成探针结合与酶切，操作简便快速，全流程仅需1.5-2小时

2）特殊设计的裂解探针有效减少次裂解产物形成，便于后续加帽率检测结果分析

3）可用于不同加帽工艺生产mRNA样品处理

4）酶切mix稳定性强，37℃ 21天，反复冻融150次，酶切活性无影响

 

此试剂盒搭配近岸蛋白特别开发的反应体系及酶切产物分子量计算工具箱，根据RNA及探针序列，选择不同碱基修饰及加帽方式，可快速预测不同酶切产物分子量，极大方便了LC-MS结果分析。

 

 

4. LC-MS测定结果

将处理好的样品上机（LC-MS）测定mRNA加帽率

UV色谱图与TIC总离子流图显示，本试剂盒处理纯化后的样品在目标峰附近无杂质、无干扰，酶切产物信号值强

 

目标峰原始质谱图   

 

解卷积分析经试剂盒处理的Control mRNA Cap1加帽率为92.85%，Cap0+Cap1加帽率为97.31%

 

mRNA加帽率检测样品处理试剂盒携手加帽率检测工具箱，一站式解决探针设计及分子量计算之忧，新品上市，欢迎咨询！

  

参考文献

[1] SHANMUGASUNDARAM M, SENTHILVELAN A, KORE A R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines [J]. Chem Rec, 2022: e202200005.

  

相关产品：

应用场景	目录号	产品名称
mRNA加帽检测	CD001	mRNA Capping Detection Sample Preparation Kit（Beads）
	E134	Thermostable RNase H
mRNA加尾检测	E151	RNase T1
mRNA原料酶鉴别	PA007	mRNA Enzymes DIBA Kit
mRNA原料酶残留检测	PA101	Pyrophosphatase, Inorganic ELISA Kit
RNase残留检测	DT007	RNase Detection Kit