近岸检测服务 | mRNA加帽率检测

mRNA疫苗生产过程主要包括质粒获取、mRNA原液制备、LNP包封等环节。mRNA原液制备是生产过程中的重要环节，原液的质量控制是决定疫苗量产的关键因素。为规范和指导mRNA原料质量，2022年2月23日美国药典（USP）发布了关于“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案。今年5月31日我国国家药监局药审中心（CDE）也发布了”体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）”用于强化mRNA类药品的质量标准。这些指导原则明确对mRNA不同区域结构的完整性提出要求，如5‘-Cap帽或帽类似物结构、poly(A)长度及分布等。

mRNA的完整性确保了蛋白质的准确翻译，5’-Cap帽结构修饰^[1]可以保护mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促进翻译的起始、降低免疫原性。按照GMP标准条件，每生产一批mRNA都需要对mRNA的加帽率、颜色、杂质、内毒素含量等进行严格测定，确保出厂的mRNA完整、纯净、高质量。mRNA加帽率检测是mRNA质量控制的重要指标。

图1. 真核生物5’-Cap帽结构甲基化修饰情况^[1]

在真核细胞中，mRNA的加帽反应主要包括4步^[2]：1）RNA三磷酸腺苷酶催化新生mRNA 5’-三磷酸水解为5’-二磷酸结构；2）鸟苷酰转移酶将GMP转移到5‘-二磷酸结构中；3)RNA甲基转移酶对鸟嘌呤N7位点进行甲基化修饰，即产生Cap0帽子结构；4）在mRNA第一位核苷酸的2‘-羟基位被RNA甲基转移酶进一步进行甲基化修饰即可产生Cap1帽子结构。

图2. 真核细胞mRNA加帽过程示意图^[2]

mRNA加帽率检测
 

近岸蛋白针对mRNA加帽率的检测服务包含探针设计及合成、样本制备、LC-MS上机、检测报告出具等环节的全流程服务，同时可根据客户具体需求，选择仅LC-MS上机和检测报告出具服务。方式灵活，服务周期短，检测质量可靠。

1. 检测原理

利用一种特殊裂解探针法进行mRNA加帽率分析。通过设计mRNA 5’端互补探针，退火形成RNA/DNA杂合链，利用RNaseH在特定位置从mRNA的5'末端切割短序列，并用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）分析获得加帽率。

2. 样品前处理 

此处理首先通过设计mRNA 5’端裂解探针，待探针与目标mRNA形成DNA/RNA杂交双链后，引导RNase H在特定位置切割mRNA。再用链霉亲和素磁珠捕获与切割的片段配对的生物素标记的切割探针，将切割片段分离。最后更换溶剂条件，从探针中释放结合的mRNA，含有裂解产物与探针的上清液用于LC-MS分析。 

图3. mRNA加帽率检测仪器 Agilent 6545 Q-TOF

上机检测过程：

  图 4. 总离子流色谱图   

  图 5. 目标峰原始质谱图   

图 6. 去卷积质谱图

3. mRNA 加帽率计算

通过以上检测，根据理论分子量在LC-MS结果中匹配对应的Uncapped triphos、Diphos 、G Cap、Cap0、 Cap1成分并计算峰面积占比。

Cap1加帽率=Cap1峰面积占比，Cap加帽率=Cap0峰面积占比+Cap1峰面积占比。

结果示例 

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[1] SHANMUGASUNDARAM M, SENTHILVELAN A, KORE A R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines [J]. Chem Rec, 2022: e202200005.

[2] MUTTACH F, MUTHMANN N, RENTMEISTER A. Synthetic mRNA capping [J]. Beilstein J Org Chem, 2017, 13: 2819-32.

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