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实验技巧:SDS-PAGE 电泳常见问题及指南

发布时间:2016-04-22 17:30 |  点击次数:

Q:SDS-PAGE 电泳的基本原理?
A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS(十二烷基硫酸钠), SDS 会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与 1.4 g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW 为分子量,X 为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响?
A:在 SDS-PAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是 Tris-HCL 缓冲系统,浓缩胶是 pH6.7,分离胶 pH8.9;而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其 pH 环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而 CL 离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中 pH 的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以,pH 对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。

Q:样品如何处理?
A:根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。
1、还原 SDS 处理:在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT(或 Beta 巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成 SDS 与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样 Buffer,离心,沸水煮 5 min,再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原 SDS 处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20% 的碘乙酸胺,并在室温保温 30 min。
3、非还原 SDS 处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用 1%SDS 沸水中煮 3 min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

Q:SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用?
A: 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;
制胶缓冲液:浓缩胶选择 pH6.7,分离胶选择 pH8.9,选择 tris-HCL 系统,具体作用后面介绍;
TEMED 与 AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;
十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

Q:提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径?
A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天,SDS 可水解聚丙烯酰胺。
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q:「微笑」(两边翘起中间凹下)形带原因?
A:主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。
处理办法:待其充分凝固再作后续实验。

Q:「皱眉」(两边向下中间鼓起)形带原因?
A:主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。

Q:为什么带出现拖尾现象?
A:主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。

Q:为什么带出现纹理现象?
A:主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。

Q:什么是「鬼带」,如何处理?
A:「鬼带」就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。

Q:为什么溴酚蓝不能起到指示作用?
A:我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法:更换正确 pH 值的 Buffer;降低分离胶的浓度。

Q:为什么电泳的条带很粗?
A:电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。
处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的 pH 正确(6.7);适当降低电压;

Q:为什么电泳电压很高而电流却很低呢?
A:这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上,可电流却在 5mA 以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a. 内外槽装反;b. 外槽液过少;c. 电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。
处理办法:电泳槽正确装配即可。

Q:浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?
A:这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。